Con este artículo, comenzamos a revisar algunos procedimientos propuestos por dos textos universitarios para fijar, teñir y observar muestras de microorganismos para microscopía.
CONTENIDO
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA (Manual de microbiología general, 2015)
Confección de preparados para observación en fresco
Técnica de montaje en fresco
La forma más simple de examinar microorganismos vivos es suspenderlos en agua u otro líquido, colocar una gota de esta suspensión en un portaobjetos y encima un cubreobjetos, utilizando para su observación al microscopio los objetivos secos (10 x a 40x). Para evitar la evaporación y el efecto de las corrientes de aire, se puede rodear la preparación con vaselina, que cierra el espacio exterior entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Cuando la observación es inmediata no es necesario el uso de la vaselina.
Confección de preparados para coloraciones
En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación es un procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias, preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, formaldehído y ácido acético entre otros, se utiliza para preservar las estructuras celulares.
Preparación y coloración de frotis
La forma más común de preparar un frotis es extender una pequeña cantidad de muestra sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, con un asa en anillo, previamente esterilizada a la llama del mechero y enfriada. Luego, se seca el extendido al aire aunque puede acelerarse por calentamiento suave en la cercanía de la llama del mechero. Una vez seco, el preparado debe fijarse; una forma sencilla y rápida consiste en fijar por calor, pasando el frotis suavemente sobre la llama del mechero evitando un recalentamiento excesivo del vidrio. Esto impedirá el arrastre de los microorganismos por las soluciones de colorantes y lavados durante la coloración.
Coloraciones
Las coloraciones se usan para teñir a las células aumentando así su contraste, de tal manera, que puedan observarse más fácilmente en el microscopio de campo claro. En general, consisten en cubrir el frotis seco y fijado con una o más soluciones de colorantes. Los tiempos, cantidad y tipos de colorantes varían según el tipo de coloración empleada. Finalmente, se lava el portaobjetos con agua, se seca, se coloca una gota de aceite de inmersión y se observa al microscopio con objetivo de inmersión de 100x (Figura 2.2). Los colorantes son compuestos orgánicos que tienen una afinidad particular por sustancias celulares específicas. Las propiedades ácidas o básicas de los colorantes permiten su fácil clasificación en:
Colorantes ácidos. Estos ionizan en soluciones acuosas para producir un núcleo colorante con carga negativa, es decir, el grupo iónico que imparte el color tiene carga negativa (anión). Dichos colorantes se combinan con constituyentes celulares cargados positivamente (proteínas). Por ejemplo: eosina, rojo Congo, fucsina ácida.
Colorantes básicos. En los que el ion que lleva el color tiene carga positiva. Dichos colorantes tienen afinidad por el material nuclear y otros componentes. Estos son los más usados en microbiología, ya que debido a la gran cantidad de ribosomas que contienen ácido ribonucleico en todo el protoplasma de la célula bacteriana, éstas se tiñen fácilmente. Por ejemplo: azul de metileno, fucsina básica, cristal violeta, safranina.
Figura 2.2. Preparación de un extendido o frotis y tinción simple
Tinción simple
Se utiliza un colorante, generalmente básico, como por ejemplo, azul de metileno, cristal violeta y fucsina. Todos los microorganismos toman el mismo color, con este tipo de coloración no se pretende diferenciar microorganismos o estructuras celulares. La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido. Las técnicas de coloración simple pueden ser positivas o negativas. En las tinciones positivas el colorante es fijado por las células apareciendo los microorganismos de color oscuro o coloreado sobre un fondo luminoso o claro. Ejemplo: tinción de azul de metileno, tinción de Gram, etc. Mientras que, en las tinciones negativas los microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tiñe y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro. Ejemplo: tinción con nigrosina.
Tinción diferencial
Se denominan así los procedimientos de coloración que ponen de manifiesto diferencias entre las células microbianas o entre subestructuras de una misma célula. Básicamente comprenden el empleo de más de un colorante, mordientes y/o decolorantes específicos.
Ejemplos: tinción de Gram, tinción de endosporas, etc. Generalmente, en las tinciones diferenciales los microorganismos se tiñen con la ayuda de una sustancia química denominada mordiente. Una de las funciones de un mordiente es aumentar la afinidad de una muestra biológica por un colorante; otra es cubrir una estructura (como un flagelo) para darle mayor espesor y facilitar la observación después del teñido. Algunos ejemplos de mordientes son: soluciones de oxalato amónico, ácido tánico, sales de aluminio, estaño, zinc, cobre, iodo, etc.
TINCIONES COMÚNMENTE USADAS EN MICROBIOLOGÍA (Manual de microbiología general, 2015)
Coloración de azul de metileno (tinción simple, directa, positiva)
Se cubre el frotis ya fijado con la solución de colorante durante aproximadamente 5 minutos. Lavar con agua, secar y observar al microscopio.
Coloración de Gram (tinción diferencial)
La tinción de Gram fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884 y es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial, sobre la forma, tamaño y agrupación celular. La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos según el tipo y composición de la pared que presentan: bacterias con pared de tipo Gram positiva y bacterias con pared de tipo Gram negativa.
PROCEDIMIENTO
a) Preparar el frotis en la forma ya indicada.
b) Cubrir el frotis ya fijado con cristal violeta y dejar actuar durante 1 min.
c) Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparación. b) Cubrir con solución de Lugol (I3K), dejar actuar durante 1 min y lavar con agua.
c) Cubrir con alcohol-acetona, durante 10 s y lavar con agua (3 veces).
d) Cubrir con solución de fucsina básica o safranina (si se usa la fucsina fenicada se diluye 1/10), dejar actuar 30 s y lavar con agua. Secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x).
RESULTADOS
Con esta coloración las bacterias se presentan de dos colores distintos, las llamadas GRAM POSITIVAS, de color azul a violeta, y las llamadas GRAM NEGATIVAS, de color rosado a rojo (Figura 2.3).
Figura 2.3. Tinción de Gram (http://www.mysvarela.nom.es/microbiologia/bacterias3.htm)
FUNDAMENTO
Las bacterias reaccionan de modo distinto frente a la tinción de Gram porque las diferencias estructurales en sus paredes determinan la retención o el escape del complejo cristal violeta/yodo (lugol). Entre otras diferencias las bacterias Gram positivas tienen un peptidoglucano en su pared celular más grueso que las bacterias Gram negativas. Por otro lado, las bacterias Gram positivas presentan un polímero con un gran número de uniones cruzadas dando como resultando un plano de malla pequeña, mientras que, las bacterias Gram negativas presentan un polímero con pocos entrecruzamientos que determina una malla planal de “criba” o tamiz grande. Por lo tanto, al agregar el yodo se forma un complejo cristal violeta/mordiente con un tamaño molecular mayor al del tamiz del peptidoglucano de las bacterias Gram positivas y menor al tamiz de las Gram negativas. En consecuencia, cuando se decolora el preparado con alcohol o alcohol-acetona, las células Gram positivas retienen el complejo colorante-mordiente y permanecen de color violeta. En cambio, en las células Gram negativas el alcohol altera la capa externa de lipopolisacárido y el complejo colorante/mordiente se elimina de la capa delgada de peptidoglucano. Como consecuencia, las células Gram negativas son incoloras hasta que se agrega el colorante de contraste rojo (fucsina o safranina), después de lo cual aparecen de color rosado.
LAS TÉCNICAS MICROGRÁFICAS (Barsallo et al., 2011)
INTRODUCCIÓN
Las técnicas micrográficas son los distintos métodos que se requieren para poder observar en el microscopio las estructuras celulares.
La célula puede ser estudiada bajo diversos aspectos: morfológicos, químicos y fisiológicos.
Las preparaciones se llevan a cabo con el portaobjetos; es lo primero que se necesita para poder hacer observaciones al microscopio, luego se usará la técnica que se requiera.
Debido a la transmisión de la luz en el microscopio, las técnicas de observación exigen que los objetos a estudiar respondan a ciertas condiciones. Para que la luz pueda atravesarlo deben tener poco espesor (del orden de algunas micras), por lo que hay que efectuar cortes muy finos. La observación al microscopio sólo proporciona información si ciertas regiones del objeto absorben luz mejor que otras, es decir, si el objeto presenta contrastes, en general los constituyentes celulares tienen muy pocos contrastes uno con respecto a otros, por lo cual es necesario usar ciertos artificios para aumentarlos; por ejemplo, se crean artificialmente ciertos contrastes realizando combinaciones entre los constituyentes químicos celulares y productos que absorban ciertas longitudes de onda de la luz, llamados técnicas de tinción.
Los cortes de algunas micras de espesor sólo pueden efectuarse si la dureza de la muestra es apropiado. Si la muestra es muy blanda, es necesario endurecerla artificialmente para poder cortarla. Esto se puede lograr actuando sobre el constituyente más abundante de las células, que es el agua, haciéndola pasar del estado líquido al sólido y congelando la célula por medio de la técnica de congelación, o bien, sustituyéndola por otro líquido que pueda ser endurecido en ciertas condiciones. Esto se conoce como el método de inclusión.
Sin embargo, estos métodos que permiten endurecer las células alteran en modo considerable su organización. Por eso es necesario consolidar previamente las estructuras por medio de una serie de operaciones que constituyen la fijación. Es un tratamiento físico o químico efectuado sobre células vivas, que permite ciertas manipulaciones posteriores con un mínimo de alteración en las estructuras celulares y mantener su morfología.
Si las preparaciones quieren conservarse de forma permanente se les llaman preparaciones permanentes, y las que son para uso sólo del momento son las preparaciones temporales.
Hay un gran número de métodos y técnicas para la observación de la gran cantidad de materiales biológicos. El más simple es el montaje simple en un portaobjetos con cubreobjetos, usando un colorante vital y observándolo al microscopio; y uno más complejo sería, la fijación - inclusión - corte - coloración - montaje - sellado. En el laboratorio se trabaja con material biológico del nivel celular, por lo que se hace necesario el uso de algunas técnicas micrográficas para poder hacer observaciones más precisas.
PRÁCTICA MUCOSA BUCAL
B. Tejido epitelial. Mucosa bucal
OBJETIVO
• Conocer algunas técnicas micrográficas básicas para el laboratorio de biología
MATERIALES Y REACTIVOS
• Microscopio
• Portaobjetos y cubreobjetos
• Juego de disección
• Orceína aséptica
• Hematoxilina
• Alcohol etílico
• Bálsamo de Canadá
• Alas de mariposa
• Cinta adhesiva transparente
• Palillos de dientes que tengan un extremo
plano
• Metanol al 95%
PROCEDIMIENTO
1. Raspa la cara interna de tu mejilla con un palillo.
2. Extiende las células sobre un portaobjetos limpio. Fijación con metanol al 95% durante el 3. frotis, espera 15 minutos. Retira el exceso de alcohol.
3. Sécalo al aire (para mayor rapidez abanica el portaobjetos).
4. Sumerge durante cinco minutos en orceína acética al 2%.
5. Lava con agua por ambos lados del portaobjetos, a fin de quitar el exceso de colorante. 6. 6. Seca al aire.
7. Observa al microscopio con el objetivo de menor aumento, localiza la zona que deseas estudiar.
8. Observa con el objetivo de 40X. Dibuja
NOTA: Podemos adaptar este práctico a las tinciones y materiales disponibles en el laboratorio; los resultados serán más o menos diferentes pero nos permitirán pasar por la experiencia de observar detalles microscópicos de nuestras propias células.
REFERENCIAS
Barsallo, E., Cabrera, F., & Ferrer, E. (2011). Manual de talleres y laboratorios de Biología 10 (Segunda edición). PEARSON EDUCACIÓN, México.
Reynoso, M., Magnoli, E., Barros, G., & Demo, S. (2015). Manual de microbiología general (Primera edición). UniRío editora. Universidad Nacional de Río Cuarto.